การทดลองนี้ทำเพื่อศึกษาความสามารถในการดูดกลืนแสงของสารสีที่พบในคลอโรพลาสต์ คือ คลอโรฟิลล์ และ แคโรทีนอยด์  ซึ่งเป็นสารสีที่ใช้ในกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสง  โดยใช้เครื่องวัดการดูดกลืนแสง (spectrophotometer) แทนการใช้ปริซึม (ดังที่มีอยู่ในหนังสือเรียนชีววิทยา)  ทั้งนี้เพราะโรงเรียนหลายแห่ง โดยเฉพาะโรงเรียนในสังกัดสามัญศึกษาจังหวัดต่าง ๆ มีเครื่องวัดการดูดกลืนแสงอยู่แล้ว  การวัดการดูดกลืนแสงหรือสเปคตรัมของสารสีโดยใช้เครื่องมือดังกล่าว นอกจากจะเป็นวิธีการที่ทำได้ง่าย สะดวก ยังให้ผลการทดลองที่ชัดเจน ง่ายต่อการทำความเข้าใจ และให้ข้อมูลที่มากกว่า ซึ่งเป็นประโยชน์ต่อการเรียนรู้ด้วยตนเองได้มากขึ้น ฉะนั้น สำหรับในโรงเรียนที่มีเครื่องมือวัดการดูดกลืนแสงอยู่แล้ว  ขอแนะนำให้เปลี่ยนการทดลองดังกล่าว จากการใช้ปริซึมในกล่องกระดาษดำ เป็นการใช้เครื่องมือวัดการดูดกลืนแสง

 

หลักการดูดกลืนแสงของสารสี (โปรดคลิกเพื่อดูรายละเอียดใน video clip) อาจอธิบายได้ดังนี้ คือ
การที่สารสี คลอโรฟิลล์ มีสีเขียวนั้น หมายความว่า เมื่อแสงที่ไม่มีสีหรือแสงที่มองไม่เห็นด้วยตาเปล่าไปกระทบมันจะเกิดการดูดแสงสีอื่น ๆ ไว้มาก  จนกระทั่งแสงที่ทะลุและสะท้อนออกมาสู่ตาเราเห็นเป็นสีเขียว ในกรณีนี้ แสงที่คลอโรฟิลล์ดูดไว้มาก จะเป็นแสงสีน้ำเงินและสีแดง ทำให้เราเห็นสีเขียว ในทำนองเดียวกัน แคโรทีนอยด์จะสามารถดูดสีน้ำเงินได้มาก และดูดสีอื่น ๆ ได้น้อย แสงที่ปรากฏแก่ตาเราจึงเป็นสีส้มค่อนไปทางแดง
 
ถ้าเราใช้ ปริซึม มากระจายแสงที่ไม่มีสี เราก็จะเห็นแถบสีรุ้งเกิดขึ้น คือ แดง  แสด เหลือง  เขียว   น้ำเงิน  คราม  ม่วง  ดังนั้น เมื่อแสงที่ไม่มีสีที่ทะลุผ่านสารละลายคลอโรฟิลล์  ซึ่งจะดูดแสงสีน้ำเงินและสีแดงไว้  แสงที่ผ่านสารละลายคลอโรฟิลล์เข้าปริซึม และถูกกระจายออก จะเห็นเป็นแถบสีดำตรงที่ควรจะมีแถบสีน้ำเงินและแดง แถบสีดำนี้คือแถบที่ไม่มีแสงผ่านมา เพราะเป็นแถบของแสงที่ถูกดูดไปแล้วโดยสารละลายคลอโรฟิลล์  ในทำนองเดียว ถ้าทำการทดลองโดยใช้หลอดแก้วบรรจุสารละลายแคโรทีนอยด์ และกระจายแสงที่ผ่านมาโดยปริซึม ก็จะปรากฏเป็นแถบสีดำตรงบริเวณที่ควรจะมีสีน้ำเงินอยู่
 
เครื่องวัดการดูดกลืนแสง สามารถใช้วัดความสามารถในการดูดกลืนแสงของสารละลายคลอโรฟิลล์และแคโรทีนอยด์ได้เป็นอย่างดี  โดยที่เราจะสามารถวัดการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นต่าง ๆ เห็นปรากฏเป็น สเปคตรัม  ซึ่งอาจเปรียบได้เป็นรูปร่างของยอดเขา คือจุดที่มีค่าดูดกลืนแสงสูงสุดที่เรียกกันโดยทั่วไปว่า   peak   เหว คือจุดที่มีค่าดูดกลืนแสงลดต่ำที่สุดก่อนที่จะขึ้นเป็น   peak   ใหม่ และที่ราบ คือจุดที่แทบจะไม่มีค่าดูดกลืนแสงเลย ดังแสดงในรูปที่ 1 ซึ่งเป็นค่าดูดกลืนแสงของคลอโรฟิลล์และแคโรทีนอยด์และที่ราบ ดังในแสดงในรูปที่ 1 (รูปนี้นำมาจากหนังสือชีววิทยา เล่ม 3  ว049  ภาพ 2.13  หน้า 65)

 
   รูปที่  1  กราฟแสดงค่าดูดกลืนแสง (สเปคตรัม) ของคลอโรฟิลล์ เอ บี และแคโรทีนอยด์

 
จากสเปคตรัมที่เห็น และแถบสีที่กำกับไว้ข้างล่าง จะเห็นว่าคลอโรฟิลล์ดูดแสงที่ความยาวคลื่น   400 – 450 nm   ซึ่งเป็นแถบของแสงสีน้ำเงิน และที่ประมาณ 660 nm ซึ่งเป็นแถบของสีแดงส้ม  สเปคตรัมที่ได้จากเครื่อง spectrophotometer จะให้ข้อมูลมากกว่าการวัดสเปคตรัมโดยใช้ปริซึมเข้าช่วย  เพราะจะสามารถบอกได้ถึงอัตราส่วนของความสามารถในการดูดแสง ดังแสดงได้จากความสูงของ peak  ที่ความยาวคลื่น ต่าง ๆ  นอกจากนั้นจำนวนของ  peak  และอัตราส่วนความสูงของ peak ต่าง ๆ ที่ปรากฏให้เห็นนั้นไม่เพียงแต่จะแสดงถึงความสามารถในการดูดกลืนแสง ยังสามารถบ่งชี้ถึงชนิดของสารสีได้ เช่น คลอโรฟิลล์ เอ มี  peak  ใหญ่ที่ 420 nm และ 680 nm  และยังมี peak เล็ก ๆ ที่ตำแหน่งอื่น ๆ อีก  ส่วนคลอโรฟิลล์ บี   ถึงแม้ว่า  ปรากฎต่อสายตาเป็นสีเขียวเหมือนคลอโรฟิลล์ เอ  แต่จะมี peak ใหญ่ที่ 470 nm และ 640 nm  และมี peak เล็กอื่น ๆ ที่มีอัตราส่วนและตำแหน่งต่างจากของคลอโรฟิลล์ เอ  ดังนั้น ถ้ามีคลอโรฟิลล์ เอ และ บี ผสมกัน ลักษณะของ peak ก็จะเป็นผลรวมของคลอโรฟิลล์ เอ และ บี ตามสัดส่วนความเข้มข้นของแต่ละตัว
 
สำหรับสเปคตรัมของแคโรทีนอยด์ ก็จะเป็นในทำนองเดียวกัน คือมี peak ใหญ่อยู่ที่ 420 nm  470 nm และ 500 nm  และไม่มีที่อื่น ๆ เลย  ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ว่าสารนี้เป็นแคโรทีนอยด์  นอกจากนี้ความสูงของ peak ยังบอกได้ว่ามีสารมากหรือน้อยด้วย  ซึ่งถ้าใช้ปริซึมวัดจะบอกได้ยากมาก

1. ใบไม้ / แครอท  ประมาณ  20  กรัม

2. แอลกอฮอล์ 95% จำนวน  50 ml

3. ปิโตรเลียมอีเทอร์ (หรือจะใช้เฮกเซนแทนก็ได้) จำนวน  100 ml

4. มีดสำหรับหั่นใบไม้

5. ครกบดสาร (หรืออาจใช้เครื่องปั่นแทนก็ได้)

6. กรวยกรอง

7. กระดาษกรอง

8. ขวดแก้วรูปชมพู่ ขนาด  250 ml

9. กระบอกตวง ขนาด  50  หรือ  100 ml

10. หลอดหยดสาร

11. เครื่องวัดการดูดกลืนแสง (visible-spectrophotometer)   (โปรดคลิกเพื่อดูรายละเอียดขององค์ประกอบ และการใช้เครื่องมือใน video clip) พร้อม cuvette (หลอดสำหรับวัดการดูดกลืนแสง) ชนิดที่เป็นแก้ว  (ห้ามใช้  cuvette  ที่เป็นพลาสติก  เพราะจะถูกทำลายโดยสารละลายอินทรีย์ที่ใช้)

 

1. นำใบไม้หรือพืชผักต่าง ๆ มาล้างน้ำให้สะอาด แล้วตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ นำไปบดให้ละเอียด

2. นำใบไม้ที่บดละเอียดแล้วมาชั่งให้ได้ประมาณ 20 กรัม ใส่ในขวดรูปชมพู่

3. เติมแอลกอฮอล์ 95% จำนวน 50 ml และปิโตรเลียมอีเทอร์ (หรือเฮกเซน)  35 ml

4. ปิดฝา แช่ทิ้งไว้ประมาณ 15 นาที เขย่าขวดเป็นครั้งคราว

5. กรองสารละลายที่สกัดได้ด้วยกระดาษกรอง ใส่ในขวดแก้วรูปชมพู่ ควรปิดฝาขวดด้วยกระจกนาฬิกา หรือจุกแก้ว เพื่อกันการระเหย

6. ตั้งทิ้งไว้ สารละลายจะแยกออกเป็น 2 ชั้น

รินสารละลายชั้นบนเก็บเอาไว้  ปิดฝาด้วยกระจกนาฬิกา หรือจุกแก้ว สำหรับวัดสเปคตรัมของรงควัตถุที่สกัดได้จากพืช (วิธีการสกัดสารนี้เป็นวิธีเดียวกันกับที่อยู่ในหนังสือชีววิทยา เล่ม 3 ว 049 หัวข้อ 2.3)

 


วิธีการใช้เครื่อง Spectrophotometer (โปรดคลิกเพื่อดู video clip ของวิธีการใช้เครื่อง)

1. เสียบปลั๊กไฟของตัวเครื่องเข้ากับปลั๊กจ่ายกระแสไฟฟ้า

2. หมุนปุ่มปรับศูนย์ (zero adjustor) ตามเข็มนาฬิกาจน POWER “ON” เปิดเครื่องทิ้งไว้ให้เครื่อง warmup ประมาณ 5-10 นาทีก่อนใช้งาน

3. หมุนปุ่มปรับช่วงคลื่น (wavelength scale control) ให้ได้ความยาวคลื่นแสงตามที่ต้องการโดยดูจากหน้าปัทม์

4. ปิดฝาช่องใส่สารตัวอย่าง (sample holder) ให้สนิท ใช้ปุ่มปรับศูนย์ (zero adjustor) ปรับให้เข็มบนสเกลหน้าปัทม์อยู่ที่ตำแหน่ง Transmittance หรือ OD (Optical Density)

5. บรรจุสายละลาย blank (ดูหมายเหตุ) ในหลอดสารตัวอย่าง (test tube cuvette)  ให้ได้ความสูงอย่างน้อย 3 ซม หรือประมาณ ¾ จากก้นหลอด เปิดฝา sample holder แล้วสอดหลอดสารตัวอย่างเข้าไปในช่อง sample holder

6. ปิดฝา sample holder ใช้ปุ่มปรับปริมาณแสง (light control knob) ให้ปรับเข็มบนสเกลหน้าปัทม์อยู่ที่ตำแหน่ง 0 OD หรือ 100%T

7. เปิดฝา sample holder เอาหลอด blank ออก ใส่หลอดสารตัวอย่างที่ต้องการวัดค่า absorbance (ค่าดูดกลืนแสง) ลงไปแทน ปิดฝาให้สนิท อ่านค่า absorbance (A) หรือ อาจเรียกว่าค่า optical density (OD) ก็ได้ จากสเกลบนหน้าปัทม์

หมายเหตุ

	blank หมายถึง สารละลายที่ไม่มีตัวอย่างที่ต้องการวัด ในที่นี้ blank คือสารละลายที่ใช้สกัด คือ ปิโตรเลียมอีเทอร์หรือเฮกเซนก็ได้
	การจับหลอด cuvette ให้จับปลายด้านบนบริเวณปากหลอดเท่านั้น หากพบว่ารอยนิ้วมือเปรอะเปื้อนบริเวณปลายด้านล่างของหลอด
	ให้ใช้กระดาษเยื่อเช้ดให้สะอาดก่อนใส่ลงไปวัดค่า absorbance ในเครื่อง
	เครื่อง spectrophotometer มีหลายรุ่น แต่ละรุ่นมีวิธีการใช้งานกว้างๆ คล้ายกับที่เขียนไว้ในหัวข้อข้างบนนี้
	จะมีแตกต่างบ้างในรายละเอียดเล้กน้อย spectrophotometer รุ่นใหม่จะให้ค่าเป็นตัวเลขดิจิตอล ไม่ต้องอ่านค่าจากสเกลบนหน้าปัด

สารละลายที่สกัดได้นั้น มักจะมีปริมาณสารสี (คลอโรฟิลล์ หรือแคโรทีนอยด์) มากเกินไปกว่าที่เครื่อง spectrophotometer จะอ่านค่าได้อย่างถูกต้อง ฉะนั้นจึงต้องนำสารละลายที่สกัดได้ มาเจือจางลง 50 เท่า (* ดูหมายเหตุเพิ่มเติม) โดยใช้สารที่สกัดได้ 0.5 ml แล้วเติม    ปิโตรเลียมอีเทอร์ 24.5 ml  ผสมให้เข้ากันแล้วนำมาวัดค่าการดูดกลืนแสง (OD) ด้วยเครื่อง spectrophotometer ที่ความยาวคลื่นตั้งแต่ 350 ถึง 750 nm โดยเว้นช่วงห่างกันช่วงละ 10 nm (โดยต้องตั้ง blank ใหม่ทุกครั้งที่เปลี่ยนความยาวคลื่น) โดยทำตามขั้นตอน ดังต่อไปนี้

1. เสียบปลั๊ก และเปิดเครื่อง spectrophotometer เปิดเครื่องทิ้งไว้ให้เครื่อง warmup ประมาณ 5-10 นาที ก่อนการใช้งาน

2. เริ่มวัดความสามารถในการดูดกลืนแสงของสารละลาย โดยเริ่มที่ 350 nm ก่อน โดยหมุนปุ่มปรับช่วงความยาวคลื่น (wavelength scale control) ให้ได้ความยาวคลื่นที่ 350 nm

3. ปิดฝาช่องใส่สารให้สนิท (ไม่มีหลอดสารอยู่ในเครื่อง) หมุนปุ่มปรับศูนย์ (zero adjustor) ให้เข็มบนสเกลหน้าปัทม์อยู่ที่ตำแหน่ง 0% หรือ OD

4. บรรจุสารละลาย blank (ซึ่งในการทดลองนี้ใช้ปิโตรเลียมอีเทอร์เป็น blank) ในหลอดวัดสาร (test tube cuvette) ให้ได้ความสูงอย่างน้อย 3 /4 จากก้นหลอด เปิดฝาช่องใส่สาร แล้วเอาหลอด blank ใส่เข้าไป

5. ปิดฝาช่องใส่สาร แล้วหมุนปุ่มปรับปริมาณแสง (light control knob) ให้เข็มบนสเกลหน้าปัทม์อยู่ที่ตำแหน่ง 0  OD หรือ 100% T

6. เปิดฝาช่องใส่สาร เอาหลอด blank ออก ใส่หลอดสารที่ต้องการวัดค่า OD ลงไปแทน ปิดฝาให้สนิท   
อ่านค่า OD จากสเกลบนหน้าปัทม์ (เป็นค่า OD ที่ 350 nm) จดค่าที่อ่านได้ในตารางบันทึกผล

7. เปิดฝาช่องใส่สาร เอาหลอดสารที่ต้องการวัดออก

8. เปลี่ยนความยาวคลื่นเป็น  360 nm โดยหมุนปรับช่วงความยาวคลื่นให้ได้ที่ 360 nm

* ตั้ง blank  ใหม่ที่ช่วงความยาวคลื่นที่ปรับใหม่ คือ 360 nm โดยเปิดฝาช่องใส่สาร ใส่หลอด blank  ปิดฝาช่องใส่สารให้สนิท แล้วหมุนปุ่มปรับปริมาณแสงให้เข็มบนสเกลหน้าปัทม์อยู่ที่ตำแหน่ง 0 OD หรือ 100% T  เปิดฝาช่องใส่สาร เอาหลอด blank ออก ใส่หลอดสารที่ต้องการวัดค่า OD (หลอดเดิมจากข้อ 6)  ลงไปแทน ปิดฝาให้สนิท อ่านค่า OD  ที่ 360 nm จากสเกลบนหน้าปัทม์ จดค่าที่ได้ในตารางบันทึกผล

9. อ่านค่า OD ที่ความยาวคลื่นต่าง ๆ ต่อ ตั้งแต่ 370-750 nm โดยเว้นช่วงเหมือนที่แสดงไว้ในตารางบันทึกผล  โดยเปลี่ยนความยาวคลื่นให้เป็นตามที่ต้องการและทำซ้ำเหมือนข้อ 8

10. นำค่าที่บันทึกไว้ในตารางมาเขียนกราฟ  โดยให้ความยาวคลื่นอยู่ในแกน X และค่า OD อยู่ในแกน Y (ดูตัวอย่างกราฟที่ให้มา ซึ่งเป็นการทดลองวัดค่าดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นต่างๆ ของสารสีที่สกัดจากใบไม้ 3 ชนิด และแครอท)

หมายเหตุ  :  ถ้าสารละลายที่สกัดได้ (ซึ่งนำมาเจือจางแล้ว 50 เท่า) มีค่า OD มากกว่า 1.0 ให้ทำสารละลายนั้นให้เจือจางลงอีก 1 หรือ 2 เท่าตัว โดยแบ่งสารละลายนั้นออกมาแค่ 2 ml แล้วเติมปิโตรเลียมอีเทอร์ไปอีก 1 เท่า (2 ml) หรือ 2 เท่า (4 ml)

 

รูปที่  2

รูปที่  3

 ผู้ทำการทดลอง   ......................................        วันที่ทำการทดลอง  .................................................

หมายเหตุ ขอให้วัดที่ 375 nm เพิ่มเติมอีกจุด นอกเหนือจากที่เว้นช่วงละ 10 nm เพื่อให้เห็นว่ามีไหล่ peak เล็กๆ ที่ 375 nm

สเปคตรัมที่ได้จากการเขียนกราฟระหว่าง OD และความยาวคลื่น แสดงว่า สารสีจาก

ใบ  ................................... มี  peak  ที่ ....................และ.................... nm   แสดงว่าเป็นชนิด .............................................

แครอท ............................. มี  peak  ที่ ....................และ..................... nm  แสดงว่าเป็นชนิด ...............................................

1. ทำไมเครื่อง spectrophotometer  ต้องมีสิ่งที่ช่วยกระจายแสงคล้ายปริซึม

2. ถ้าสารละลายมีสีแดง  ท่านคิดว่าควรจะมียอด (peak)  ของสเปคตรัม อยู่ที่ความยาวคลื่นใด

3. ถ้าเอาสารละลายคลอโรฟิลล์ ไปทำให้เจือจาง ½ เท่า  ท่านคิดว่าสเปคตรัม จะเปลี่ยนไปในทำนองใดบ้าง ขอให้ตอบในลักษณะความสูงและตำแหน่งของยอด (peak)

4. จากผลการทดลองวัดสเปคตรัมของใบไม้  3  ชนิด  และของแครอท ดังแสดงในรูปที่  3  ท่านคิดว่าใบไม้ทั้ง  3  ชนิด  และแครอท มีสารสีเหมือนหรือต่างกันอย่างไร  ตอบทั้งในแง่ชนิดและปริมาณ

5. สารสีทำหน้าที่อย่างไรในการสังเคราะห์ด้วยแสง