วิธีใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ (application)
 

         เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์แต่ละแบบอาจมีเทคนิคการใช้และวิธีการใช้
แตกต่างกันบ้าง ซึ่งผู้ใช้ต้องศึกษาคู่มือการใช้งานโดยละเอียดก่อน สําหรับวิธีใช้
เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์โดยทั่วไปมีดังนี้
1.   ถอดถุงคลุมเครื่องออก
2.   เปิดสวิทซ์ไฟฟ้าเพื่ออุ่นเครื่องนาน 30 นาที
3.   ปิดแสงจากภายในหรือภายนอกไม่ให้ตกกระทบตัวไวแสง โดยการปิดฝาครอบ
      ช่องใส่คิวเวทท์และปิดช่องแสงออก
4.   เลือกความยาวคลื่นแสงที่ต้องการวัดโดยปรับปุ่มเลือกความยาวคลื่น
5.   ปรับเครื่องเป็น 100%T หรือตั้งค่าการดูดกลืน ให้เป็นศูนย์ด้วยปุ่มปรับศูนย์       (ปุ่ม calibrate)   
6.   ใส่สารละลายอ้างอิง (reagent blank) ลงในช่องใส่คิวเวทท์ ปิดฝาช่องใส่คิวเวทท์
7.    ปรับ 100%T หรือค่าการดูดกลืนให้เป็นศูนย์ด้วยปุ่มปรับศูนย์การปรับใน
      ขั้นตอนนี้ต้องกระทําทุกครั้งที่มีการเปลี่ยนความยาวคลื่นแสงที่ใช้วัด
8.    ใส่สารตัวอย่างลงในช่องใส่คิวเวทท์ ปิดฝาช่องใส่คิวเวทท์
9.    อ่านค่า %T หรือ absorbance
10.  หลังเสร็จการใช้งาน ปิดสวิทซ์ไฟฟ้า ปล่อยให้เครื่องเย็นก่อนคลุมเครื่อง
       ด้วยถุงคลุมเครื่องมือ
 

 ตัวอย่างเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ในปัจจุบัน
 
 
 UV-Vis Spectrophotometer ของ Shimadzu
สามารถวัดการดูดกลืนได้ทั้งในช่วงแสงอัลตราไวโอเลต และแสงที่มองเห็นได้
และสามารถสแกนสเปกตรัมได้
 
 
 Visible spectrophotometer ของ Jenway
สามารถวัดการดูดกลืนแสงได้ในช่วงแสงที่มองเห็นได้
 
 
 Color reader ของมหาวิทยาลัยมหิดล
สามารถวัดการดูดกลืนแสงในช่วงแสงสีแดงและสีน้ำเงิน
 
รูปที่ 4.10 เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์แบบต่างๆ
 

 
 
1. Molecular fluorescence spectrometry
 

        นอกจากยูวี-วิสิเบิล สเปกโทรโฟโตมิทรี (UV-Vis Spectrophotometry) ซึ่งเป็นการวัดค่าการดูดกลืนแสงของสารแล้ว ยังมีเทคนิคหนึ่งที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในปัจจุบัน สำหรับการวิเคราะห์โมเลกุลบางชนิด นั่นคือเทคนิค fluorescence spectrometry เทคนิคนี้จะวัดการคายแสงที่เรียกว่าฟลูออเรสเซนส์ของสาร ข้อดีของเทคนิคนี้คือให้ขีดต่ำสุดในการวัด (detection limit) ดีกว่าเทคนิคยูวี-วิสิเบิล
สเปกโทรโฟโตมิทรี และยังมีความจำเพาะเจาะจง (selectivity) ต่อโมเลกุลที่จะวิเคราะห์มากกว่าอีกด้วย อย่างไรก็ตาม ในด้านหลักการของเครื่องมือนั้น เครื่อง
สเปกโทรฟลูออโรมิเตอร์ (spectrofluorometer) จะมีความซับซ้อนมากกว่าเครื่อง
ยูวี-วิสิเบิล สเปกโทรโฟโตมิเตอร์ (UV-Vis spectrophotometer) โมเลกุลส่วนใหญ่สามารถวัดด้วยเทคนิค UV-Vis spectrophotometry ได้ แต่บางโมเลกุลเท่านั้นที่จะแสดงสมบัติการเกิดฟลูออเรสเซนต์  ดังนั้นเทคนิค fluorescence spectrometry จะเหมาะต่อการวิเคราะห์โมเลกุลบางประเภทเท่านั้น แต่จะมีความจำเพาะต่อโมเลกุลที่วิเคราะห์มาก เพราะเทคนิคนี้ต้องมีการเลือกทั้ง ความยาวคลื่น (ex) สำหรับการเร้าอิเล็กตรอน และเลือกวัดฟลูออเรสเซนต์ที่ออกมาอีก ที่ความยาวคลื่นหนึ่ง (em) ของแต่ละโมเลกุลให้เหมาะสม ดังนั้นโมเลกุลอื่นที่ถูกเร้าและเกิดฟลูออเรสเซนต์ที่คนละความยาวคลื่นก็จะไม่รบกวน
 
 

รูปที่ 4.11 energy level diagram for
photoluminescent molecule
 
กระบวนการต่างๆ ขณะเกิดฟลูออเรสเซนต์ภายในโมเลกุล
 
Rate of absorption and emission
           หลังจากที่อิเล็กตรอนถูกกระตุ้นให้ขึ้นไปสู่สภาวะเร้า (excited state) แล้ว กระบวนการต่อมาคือการที่อิเล็กตรอนจะคายพลังงาน (emission) เพื่อกลับสู่
สภาวะพื้น (ground state) ซึ่งกระบวนการนี้จะเกิดขึ้นเร็วมากประมาณ
10-14-10-15 วินาที   ส่วนกระบวนการเกิดฟลูออเรสเซนต์นั้นจะใช้เวลานานกว่าคือ
life time ประมาณ 10-5-10-9 วินาที เพราะกระบวนการเกิดฟลูออเรสเซนต์นั้น
มีหลายขั้นตอนดังที่จะกล่าวถัดไป
 
Deactivation process
           การที่กระบวนการเกิดฟลูออเรสเซนต์นั้นใช้เวลาในการเกิดนานกว่าการคายพลังงานของอิเล็กตรอน นั้นเนื่องจากต้องผ่านกระบวนการดังต่อไปนี้
           vibrational relaxation
           เมื่ออิเล็กตรอนถูกเร้าขึ้นไปที่สภาวะเร้า อิเล็กตรอนจะเข้าไปอยู่ที่ระดับ
พลังงานการสั่น (vibrational level) ได้หลายๆ ระดับ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากใน
สารละลายจะมีการชนกันระหว่างโมเลกุลของสารกับตัวทำละลายตลอดเวลา ทำให้มีการถ่ายเทพลังงานส่วนหนึ่งสู่ตัวทำละลาย ดังนั้นอิเล็กตรอนที่ระดับพลังงานการสั่นต่างๆ จะลดระดับมาอยู่ที่ระดับพลังงานการสั่นที่ต่ำที่สุดของสภาวะเร้า กระบวนการ
ทั้งหมดนี้เรียกว่า vibrational relaxation  ใช้เวลาการเกิดน้อยกว่า 10-12 วินาที
          การเกิดกระบวนการฟลูออเรสเซนส์ของสารละลายนั้น จะเป็นการเปลี่ยนสภาวะ
จากระดับพลังงานการสั่นที่ต่ำที่สุดของสภาวะเร้ากลับสู่สภาวะพื้นที่ระดับพลังงาน
การสั่นต่างๆ ของสภาวะพื้น จากนั้นอิเล็กตรอนจึงค่อยเกิด vibrational relaxation อีกครั้งเพื่อลดจากระดับพลังงานการสั่นต่างๆ ที่สภาวะเร้ากลับสู่ระดับพลังงานการสั่นที่ต่ำที่สุดของสภาวะพื้น
          Internal conversion
          เป็นกระบวนการที่เกิดระหว่างโมเลกุล เกิดจากการที่อิเล็กตรอนพยามที่จะ
ลดระดับพลังงานให้ลงมาอยู่ที่ระดับพลังงานการสั่นที่ต่ำที่สุดของสภาวะเร้า จะเกิดขึ้นเมื่อสภาวะเร้า 2 สภาวะมีระดับใกล้เคียงกันจนทำให้ระดับพลังงานการสั่นของทั้งสองเกิดการเหลื่อมล้ำกัน เกิดเปลี่ยนสภาวะของอิเล็กตรอนจากสภาวะเร้าหนึ่งไปยังอีกสภาวะเร้าหนึ่งได้
 
           ตัวอย่างสเปกตรัมฟลูออเรสเซนต์ของ perylene เราสามารถเลือกความ
ยาวคลื่นใดก็ได้ที่ 310, 410 หรือ 439 nm สำหรับเป็นความยาวคลื่นในการเร้าอิเล็กตรอน และเลือกวัดฟลูออเรสเซนส์ที่ออกมาที่ความยาวคลื่นใดก็ได้ที่ความยาว
คลื่น 442, 472 หรือ 504 nm
 
 
รูปที่ 4.12 emission และ fluorescence สเปกตรัมของ  perylene
 
 
2. Molecular absorption spectrophotometry for  kinetic study
 

           งานวิจัยหลายอย่างต้องอาศัยพื้นฐานความรู้ด้านจลน์ศาสตร์ (kinetic) ทั้ง
โดยตรง เช่น การติดตามการเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของสาร การศึกษาอัตราการเกิดปฏิกิริยา หรือการหาค่าคงที่อัตรา เป็นต้น หรือแม้แต่ทางอ้อม เช่น บางปฏิกิริยาอาจเกิดเร็วหรือช้าเกินไป ดังนั้นการวัดสมบัติใดๆ ของสารจำเป็นต้องวัดที่เวลาใดเวลาหนึ่งเท่าๆ กันทุกครั้ง
           โดยทั่วไปถ้าสารสามารถดูดกลืนคลื่นแสงได้ในช่วงอัลตราไวโอเลต และแสงที่มองเห็นได้ เราสามารถศึกษา kinetic ของสารได้โดยใช้เทคนิค UV-Vis spectrophotometry เราอาจเขียนสมการทั่วไป แสดงการเกิดปฏิกิริยาใดๆ ได้ดังนี้

                     สารตั้งต้น (reactant) ----------> สารผลิตภัณฑ์ (product)

สมการนี้บอกให้ทราบว่า ขณะเกิดปฏิกิริยาเคมี ปริมาณของสารตั้งต้นจะค่อยๆ หมด
ไป  ในขณะที่สารผลิตภัณฑ์จะค่อยๆ เพิ่มปริมาณขึ้น ดังนั้นเราอาจติดตามการเปลี่ยน
แปลงของสารตั้งต้นหรือสารผลิตภัณฑ์ก็ได้
 
 
รูปที่ 4.13 การเพิ่มขึ้นของผลิตภัณฑ์และการลดลงของสารตั้งต้น
เมื่อปฏิกิริยาดำเนินไป
 
           เมื่อกราฟของสารผลิตภัณฑ์เริ่มคงที่ นั่นหมายความว่าปฏิกิริยาเริ่มเข้าสู่
สมดุล ณ เวลานี้เองเราสามารถวัดปริมาณสารผลิตภัณฑ์ได้สูงสุดและคงที่
อย่างไรก็ตาม เราไม่จำเป็นต้องวัดปริมาณสารที่สมดุลทุกครั้ง เพราะถ้าปฏิกิริยา
เข้าสู่สมดุลช้า เราจะต้องเสียเวลารอนาน แต่เราสามารถทำการวัดได้เลยที่เวลาใด
เวลาหนึ่ง แต่เราจะต้องวัดที่เวลาเดิมนี้ทุกครั้งตลอดการทดลอง
 
ยกตัวอย่าง ปฏิกิริยา
    formaldehyde (ไม่มีสี)+ Nash reagent (ไม่มีสี) ------->  yellow complex
เมื่อปฏิกิริยาเริ่มต้น สารตั้งต้นจะยังไม่มีสีจนเมื่อเวลาผ่านไปสารละลายจะค่อยๆ
เหลืองขึ้น เนื่องจากเกิดสารผลิตภัณฑ์ขึ้นเรื่อยๆ จนกระทั่งปฏิกิริยาเข้าสู่สมดุล
สีของสารละลายจะเริ่มคงที่ ดังรูป        
 
 
รูปที่ 4.14 การติดตามการเพิ่มขึ้นของผลิตภัณฑ์  (yellow complex)
 
 Quiz    ทบทวนกันหน่อย
 1.   จากปฏิกิริยา formaldehyde ถ้าเราจะติดตามการเกิดปฏิกิริยาโดยวัดการ
 ดูดกลืนแสงที่เพิ่มขึ้นของสารผลิตภัณฑ์ เราควรจะเลือกความยาวคลื่นในช่วงแสงสีใด
 สำหรับการวัดครั้งนี้
 แนวคิด
สีของวัตถุและแสงสีที่วัตถุดูดกลืน
จะเป็นสีที่อยู่ตรงข้ามกันของวงล้อสี
ดังนั้นสารผลิตภัณฑ์สีเหลือง
จึงดูดกลืนแสงสีม่วง
 
 2.   จากกราฟการติดตามการเปลี่ยนแปลงไปของปฏิกิริยาตามรูปที่ 4.14 สามารถ
 นำไปใช้ศึกษาอะไรได้บ้าง และทำอย่างไร
 แนวคิด     ช่วงแรกของการเปลี่ยนแปลงของกราฟจะชัน นั่นหมายความว่าในช่วงนี้
 ปฏิกิริยามีการเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็ว ดังนั้นความชันของกราฟในช่วงนี้ก็คือ
 อัตราเร็วของการเกิดปฏิกิริยานั่นเอง

จากรูป อัตราการเกิดปฏิกิริยาในช่วง
2 นาทีแรกได้จากการหาความชันของ
กราฟในช่วงนี้ โดย

ความชัน =